Моделирование воспаления у крыс

Способ моделирования экспериментального хронического воспаления эндометрия у крыс

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной гинекологии, и касается моделирования хронического воспаления эндометрия. Для этого крысе в маточный рог вводят 0,1 мл взвеси аутокала. Взвесь получают смешиванием аутокала с физиологическим раствором в пропорции 1:10 и двойным фильтрованием смеси сквозь марлевый стерильный материал. Начиная с третьих суток после вмешательства, проводят в течение 7 суток антибактериальную терапию препаратом широкого спектра действия. Устанавливают формирование хронического воспаления эндометрия с 41 суток эксперимента. Способ обеспечивает развитие типичных признаков заболевания, что позволяет проводить оценку эффективности разных методов лечения. 2 табл., 3 пр.

Реферат

Изобретение относится к области медицины, конкретно к экспериментальной гинекологии.

Проблема хронического эндометрита (ХЭ) остается одной из актуальных в клинической и экспериментальной медицине. По данным А.В. Шуршалиной (2007 г.), ХЭ был единственной верифицированной причиной невынашивания беременности у 52% и бесплодия у 18,8% обследованных пациенток [12]. По данным Л.Н. Кузьмичева (2002 г.), ХЭ коррелирует с высокой частотой неудач программ экстракорпорального оплодотворения и репродуктивных потерь в циклах ВРТ.

В настоящее время актуальной является проблема коррекции хронических воспалительных процессов. Возможность их изучения затруднена, так как моделирование хронического воспаления отличается сложностью и продолжительностью в сравнении с острым процессом. Поиск удобных моделей хронического воспаления продолжается.

Необходимость продолжения разработки вопросов патогенеза, методов диагностики и патогенетически обоснованной терапии данной патологии диктуется медицинской и социальной значимостью.

В настоящее время ХЭ рассматривается как клинико-морфологический синдром, который является исходом длительно существующего повреждения эндометрия инфекционным агентом, в результате чего возникают множественные вторичные морфофункциональные изменения, нарушающие циклическую трансформацию и рецепторный аппарат слизистой оболочки тела матки [8, 10].

Морфологическими критериями хронического эндометрита являются лимфоплазмоцитарные инфильтраты, обнаружение очагов фиброза в строме и в стенках спиральных артерий, преимущественно в базальном слое эндометрия [5].

В настоящее время большинство авторов отмечают возрастание роли условно-патогенных возбудителей воспалительных процессов органов малого таза (ВЗОМТ). К их числу относятся аэробные грамположительные бактерии родов: Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Corynebacterium и аэробные грамотрицательные палочки семейства Enterobacteriaceae: Escherichia coli, Enterobacter spp., Proteus spp., Klebsiella spp., Pseudomonas spp. Среди анаэробных бактерий чаще встречаются грамотрицательные неспорообразующие бактерии родов Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella и грамположительные бактерии родов Clostridium spp, Peptostreptococcus, Peptococcus [4, 7, 10, 12].

С конца XX века считается, что ведущим инициатором ВЗОМТ являются ассоциации неспорообразующих грамотрицательных (бактероиды, превотелла, фузобактерии) и грамположительных анаэробных микроорганизмов (пептострептококки и клостридии), аэробной грамотрицательной (кишечная палочка, клебсиелла, протей, энтеробактерии) и реже грамположительной микробной флоры (стрептококк, энтерококк, стафилококк) [13, 14, 15].

В настоящий момент существует несколько методик моделирования хронического воспалительного процесса внутренних половых органов: методика Тихоновской О.А. (1986 г) с использованием изолированной суточной культуры золотистого стафилококка, JIAN Zi-jian (2004) и др. предлагают внутриматочное орошение 3% уксусной кислотой в течение 3 дней, а затем контаминацию полости матки изолированной культурой E.coli и S.aureus. В работе Гаряевой Н.А., Беда Ю.В., Пермяковой А.Н. (2004) предлагается вводить флогоген в виде Staphylococcus aureus и/или Escherichia coli в дозе 3·106 микробных в парацервикальную клетчатку в области перешейка матки. Приведенные методики моделирования подразумевают работу с изолированной бактериальной культурой, что технологически сложно, требует специального оборудования и небезопасно для исследователя.

Использование в качестве возбудителя моноагента, противоречит актуальным взглядам на этиологию хронического воспаления эндометрия. Как указано выше, в современной этиологии хронических воспалительных заболеваний половых органов превалирует именно микст-инфекция.

В работе Самородиновой Л.А. (1966 г.) для моделирования хронического сальпингоофорита применяется каррагинин. Такой метод зачастую приводит к образованию гранулем, что более типично для специфического воспаления (туберкулез), доля которого как этиологического фактора не более 10%).

Предложенное изобретение позволяет сделать дешевле и безопасней для экспериментатора методику моделирования хронического воспаления эндометрия.

Для моделирования воспалительного процесса брюшины крыс используется раствор аутокаловых масс [6].

В связи с большим значением в этиологии хронического эндометрита именно условно-патогенной флоры, нами была выдвинута гипотеза о том, что моделировать хронический эндометрит можно также путем использования аутокала. Среди бактерий, культивированных из ЖКТ, более 99,9% являются облигатными анаэробами, из которых доминирующими представителями являются: Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Lactobacillus, Clostridium, Fusobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Escherichia и Veillonella [1, 2].

Аутокаловая взвесь готовится непосредственно перед экспериментом. Собирается кал половозрелых самок крыс, которым за сутки до этого не давали пищу при свободном доступе к воде. Кал смешивается с физиологическим раствором в пропорции 1:10 пропорции (Никонов В.М, 1988 г.), раствор дважды фильтруют сквозь марлевый стерильный материал.

Поскольку объем полости матки у небеременной крысы не превышает 1 мл (Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Д. (2001) Анатомия крысы), то введение больших объемов жидкости невозможно.

Эксперименты выполнены на 35 половозрелых самках белых крыс линии Вистар массой 198±3,8 г. Животные содержались в обычных условиях вивария на стандартной диете. Все эксперименты проводились в утренние часы натощак под наркозом препаратом Рометар (2-3 мг на 1 кг массы животного) с соблюдением стандартов.

Под наркозом проводили нижнесрединную лапаротомию в асептических условиях. Матку выводили в рану и тщательно обкладывали стерильными салфетками. Стенку яйцевода прокалывали тонкой инъекционной иглой и с помощью инсулинового шприца вводили каловую взвесь в полость матки. Брюшную полость ушивали наглухо послойно. С 3 суток после операции проводили антибактериальную препаратом широкого спектра действия — Цефтриаксон в соответствии с весом животного в течение 7 дней.

Исходя из данных Самородиновой Л.А. (1966) [7] о сроках формирования экспериментального хронического сальпингоофорита выведение из эксперимента решено было проводить так же, не ранее 40 суток. С 40 суток проводили выведение животного из эксперимента путем введения летальной дозы Рометара. Осуществляли забор 2 мл крови из подключичной вены, в которой определяли уровень лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ), и забор биологического материала для гистологического исследования (матку). Полученный препарат из ткани фиксировали в нейтральном забуференном формалине и после обезвоживания в серии спиртов возрастающей концентрации заливали парафином по общепринятой методике. Гистологические методы включали окраску Гематоксилин-Эозином.

Для оценки морфологической картины применяли полуколичественный метод оценки степени выраженности лимфоцитарной, плазмацитарной инфильтрации стромы эндометрия в биопсийном материале, разработанный Э.А. Казачковой [3]. Для статистической оценки использовали критерий Манна-Уитни (средние величины выражали как Me [25 и 75 перцентиль].

Вычисление лейкоцитарного индекса интоксикации проводили по общеизвестной методике Кальф-Калифа Я.Я (1941). ЛИИ является показателем процессов тканевой деградации и уровня эндогенной интоксикации (Кальф-Калиф Я.Я., 1941). ЛИИ представляет собой соотношение уровней клеток крови повышающихся при гнойных процессах (миелоциты, палочкоядерные, сегментоядерные) к клеткам, количество которых при этих процессах падает (лимфоциты, моноциты, эозинофилы). Нормальные значения ЛИИ колеблются в пределах от 0,5 до 1.5 Ед.

В первой подгруппе проводился забор гистологического материала (матка) и крови из подключичной вены в исходном состоянии. В препарате ткани, полученном в группе контроля, наблюдались единичные нейтрофилы, лимфоциты, округлые железы нормального строения, артерии без особенностей. Показатели ЛИИ находились в пределах 0,9-1,3.

Во второй подгруппе (n=5) в полость матки вводили 0,2 мл аутокаловой взвеси с целью моделирования хронического воспаления эндометрия. С 3 дня после операции проводили антибактериальную терапию препаратом Цефтриаксон в соответствии с весом животного в течение 7 дней. На 41 сутки был проведен забор матки и образцов периферической крови. В гистологическом препарате картина была более типичной для фазы п/острого воспаления: наблюдались единично плазмоциты и лимфоциты, отмечался небольшой отек стромы, большое количество лейкоцитов, нейтрофилов. Показатели ЛИИ находились в пределах 1,9-2,3. Полученные данные говорят о тенденции к генерализации воспалительного процесса и о формировании скорее подострого воспаления эндометрия, нежели хронического.

В третьей и четвертой подгруппах, в процессе моделирования хронического воспаления эндометрия животным вводили соответственно 0,1 и 0,05 мл аутокаловой взвеси по описанной выше методике. С 3 дня после операции проводили антибактериальную терапию препаратом Цефтриаксон в соответствии с весом животного в течение 7 дней. На 41 сутки был проведен забор матки и образцов периферической крови. В гистологическом материале, полученном у крыс третьей и четвертой подгрупп выявлена картина типичная для хронического воспаления эндометрия (Кузнецова А.В.): воспалительные инфильтраты из лимфоидных элементов, в меньшей степени лейкоцитов, расположенных чаще вокруг желез и кровеносных сосудов, реже диффузно, плазматические клетки, единичные макрофаги, слабовыраженный фиброз стромы, незначительный склероз стенок артерий эндометрия [4]. Видимых морфологических различий в гистологическом материале, полученном у крыс третьей и четвертой подгрупп не выявлено. Показатели ЛИИ в подгруппе 3 находились в пределах 1,2-1,5; в подгруппе 4 — 1,1-1,5.

Полученные данные говорят о том, что введение в полость матки по указанной методике от 0,05 до 0,1 мл аутокаловой взвеси приводит к формированию гистологической картины хронического воспаления эндометрия.

Необходимо отметить, что объем 0,05 мл вводить технически затруднительно, так как невозможен достоверный контроль за поступлением аутокаловой взвеси в полость матки. В дальнейшей работе мы отказались от введения объемов менее 0,1 мл.

У животных пятой подгруппы после моделирования хронического воспаления эндометрия в послеоперационном периоде не назначался антибактериальный препарат. При гистологическом исследовании у 2 из 5 животных была картина более типичная для острого эндометрита, 3 из 5 погибли до выведения из эксперимента. Показатели ЛИИ 2.4-2.7. Эти данные указывают на генерализацию процесса и необходимость в ходе моделирования хронического воспаления эндометрия использовать антибактериальные препараты.

Конкретные примеры выполнения эксперимента

Пример 1.

Половозрелую самку, массой 205 гр, находившуюся на стандартной диете, наркотизировали Рометаром (3-4 мг/кг).

После обработки передней брюшной стенки растворами антисептиков выполнена срединная лапаротомия. Матка выведена в рану, обложена стерильными салфетками. В маточный рог введена тонкая инъекционная игла и введено 0,1 мл приготовленной взвеси аутокала. Передняя брюшная стенка ушита послойно наглухо.

В течение 40 последующих суток крыса имела свободный доступ к воде и пище. С 3 суток после вмешательства проводились инъекции препарата Цефтриаксон в/м в течение 7 последующих дней. За сутки до окончания эксперимента животное находилось в состоянии пищевой депривации при свободном доступе к воде. На 41 сутки проводился забор крови из подключичной вены для оценки ЛИИ, лапаротомия и забор матки.

ЛИИ: 1,4

Результат гистологического исследования: умеренная лимфоплазмоцитарная инфильтрация стромы, единичные нейтрофилы, макрофаги, склероз спиральных артерий.

Заключение: Хронический эндометрит

Пример 2.

Половозрелую самку, массой 194 гр, находившуюся на стандартной диете наркотизировали Рометаром (3-4 мг/кг).

После обработки передней брюшной стенки растворами антисептиков выполнена срединная лапаротомия. Матка выведена в рану, обложена стерильными салфетками. В маточный рог введена тонкая инъекционная игла и введено 0,05 мл приготовленной взвеси аутокала. Передняя брюшная стенка ушита послойно наглухо.

В течение 40 последующих суток крыса имела свободный доступ к воде и пище. С 3 суток после вмешательства проводились инъекции препарата Цефтриаксон вм в течение 7 последующих дней. На 42 сутки проводился забор крови из подключичной вены для оценки лейкоформулы, лапаротомия и забор матки.

ЛИИ: 1,2

Результат гистологического исследования: лимфоплазмоцитарная инфильтрация стромы, единичные нейтрофилы, макрофаги, склероз спиральных артерий.

Заключение: Хронический эндометрит

Пример 3:

Половозрелую самку, массой 195 гр, находившуюся на стандартной диете, наркотизировали Рометаром (3-4 мг/кг). После обработки передней брюшной стенки растворами антисептиков выполнена срединная лапаротомия. Матка выведена в рану, обложена стерильными салфетками. В маточный рог введена тонкая инъекционная игла, проведена проксимально и введено 0,2 мл приготовленной взвеси аутокала. Передняя брюшная стенка ушита послойно наглухо.

В течение 40 последующих суток крыса имела свободный доступ к воде и пище. С 3 суток после вмешательства проводились инъекции препарата Цефтриаксон в/м в течение 7 последующих дней. На 41 сутки проводился забор крови из подключичной вены для оценки ЛИИ, лапаротомия и забор матки.

ЛИИ: 2,1

Результат гистологического исследования: лейкоцитарная инфильтрация стромы, множественно нейтрофилы, единичные лимфоциты, макрофаги, отек стромы, полнокровие сосудов.

Заключение: Острый метроэндометрит.

Приведенные данные показывают, что данная методика позволяет добиться поставленной цели. Удалось смоделировать хронический воспалительный процесс в эндометрии с применением доступной, безопасной и технически простой методики.

Список литературы

1. Барановский А.Ю., Кондрашина Э.А. Дисбактериоз и дисбиоз кишечника. — Санкт-Петербург: Питер. — 2000. — С. 17

2. Горин B.C., Кондранина Т.Г., Молоткова Д.Е. и др. Принципы диагностики и рациональной антибиотикотерапии гнойных и воспалительных заболеваний придатков матки. Вопр. гин., акуш. и перинатол. 2009; 8: 2: 47-55.

3. Казачкова, Э.А. Патогенез, клинико-морфологическая характеристика и лечение воспалительных заболеваний матки и придатков: дис. д-мед. наук / Э.А. Казачков. — Челябинск, 2000. — 303 с.

4. Константинова О.Д. Диагностика воспалительных заболеваний придатков матки неспецифической этиологии / О.Д. Константинова, С.В. Черкасов, Е.А. Кремлева.

5. Кузнецова А.В. Хронический эндометрит Архив патологии, 2000, №3, с 48-52.

6. Никонов В.М. Местная детоксикация в комплексном лечении разлитого аппендикулярного перитонита у детей. Автореф. Канд. Диссертации, М., 1988 г.

7. Островский В.К., Мащенко А.В., Янголенко Д.в., Макаров с.В. Показатели крови и лейкоцитарного индекса интоксикации в оценке тяжести и определении прогноза при воспалительных, гнойных и гнойно-деструктивных заболеваниях // Клин. лаб. диагностика. — 2006. — №6 — с 50-5.

8. Прилепская В.Н. Особенности инфекционных процессов нижнего отдела половых путей: Возможности терапии препаратами для локального применения: Материалы 7-го Рос нац. конгр. «Человек и лекарство». М: Медпресс-информ 2002; 15-22.

9. Самородинова Л.А. Методика создания экспериментального инфекционного сальпингита // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. — 1966. — 2. — С. 123-124.

10. Серов В.Н., Тихомиров А.Л., Лубнин Д.М. Современные принципы терапии воспалительных заболеваний женских половых органов: Методическое пособие. М., 2003; 23.

11. Тихоновская О.А. Моделирование острого и хронического воспаления придатков матки // Молодежь и научно-технический прогресс. — Тез. докл. — Томск, 1986. — С. 76.

12. Шуршалина А.В. Хронический эндометрит у женщин с патологией репродуктивной функции. Автореф. дис. … д-ра мед. наук. М.: 2007.

13. Уткин Е.В. Основные причины развития и современные тенденции в клиническом течении воспалительных заболеваний органов малого таза у женщин / Е.В. Уткин, В.А. Кулавский // Российский вестник акушера гинеколога. — 2008. — Т. 8, №1. — с. 40-44.

14. Черкасов Е.А. Кремлева и др. // Мат. VII Российского форума «Мать и дитя». — М., 2005. — с. 408-409.

15. Haggerty C.L., et al. Bacterial vaginosis and anaerobic bacteria are associated with endometritis. Clin. Infect. Dis. — 2004. — V. 39 (7). — P. 990-995.

Способ моделирования хронического воспаления эндометрия, отличающийся тем, что крысе в маточный рог вводят 0,1 мл взвеси аутокала, полученной смешиванием его с физиологическим раствором в пропорции 1:10 и двойным фильтрованием смеси сквозь марлевый стерильный материал, затем, начиная с третьих суток после вмешательства, проводят в течение 7 суток антибактериальную терапию препаратом широкого спектра действия и устанавливают формирование хронического воспаления эндометрия с 41 суток эксперимента.